循环肿瘤细胞（CTC）的EMT和CTM检测问题

肿瘤转移的种子

大部分癌症相关死亡由转移引起，转移过程中肿瘤细胞脱离原发灶，通过血流到达新的组织，并在一定条件下发展为转移灶。循环肿瘤细胞（CTC）早在140多年前就被发现，但由于其含量非常少以及分离检测方法的局限，直到近年才日益受到广泛关注。大部分CTCs在伴随外周循环的过程中发生凋亡，或直接被血细胞吞噬，只有少数能逃逸并锚着发展成为转移灶（Cancer Res 2003; 63:3805）。这提示着我们：分离、鉴定和研究最具转移潜能的CTC是关键。

CTC以单个细胞或细胞团（又称循环肿瘤微栓子，CTM）的形式存在于循环系统中。

恶性肿瘤细胞为了获得运动性和侵袭性，会丢失某些上皮细胞的表型（包括形态、表面抗原、基因表达等）并获得某些间充质细胞的表型，这就是上皮-间质转变（EMT）（图1）。多数恶性肿瘤细胞在脱离原发灶的过程中发生EMT。

最近研究发现，CTM与间质细胞表型密切相关，并且高比例的间质细胞表型CTC与化疗耐药有关（Science 2013;339:580）。另外的研究显示，CTM可抵御失巢凋亡（anoikis）、耐受细胞毒药物（J Clin Oncol 2012;30:525）、比单个肿瘤细胞具有更强的转移潜能（Clin Cancer Res2001;7:4080）。因此，CTM和间质细胞表型CTC（EMT CTC）与单个普通CTC相比，与预后的相关性可能更强。CTM和EMT的CTC该如何捕获和检测呢？

图1 CTC从原发灶到转移灶过程中表型变化的模式图（Cancer Cell 2013, 23:272）

CTC富集与鉴定亟需新一代技术

目前各种CTC富集技术基本上是基于以下三种原理：免疫捕获、细胞大小、其他特征的识别（如细胞密度、电荷、形变能力等），前两种是目前应用较多的方法。富集后对其中的CTC进行鉴定，目前主要通过免疫荧光、荧光定量PCR、FISH等分子方法检测某个或某些生物标志物而实现。由于只要把CTC富集到，就可以根据不同目的而使用不同的生物标志物来进行鉴定，因此现阶段争议较多的还是CTC富集的方法学问题。

图2 A行显示了磁珠-抗体富集方法；B行显示了物理富集方法；C行显示了最常用的细胞检测方法

基于免疫捕获原理（如以EpCAM等抗体进行阳性分选）的技术，富集获得的CTC纯度较高。但多项研究均发现该类方法很容易漏掉那些最具有侵袭潜能的肿瘤细胞：

1）由于CTC在EMT过程中，会出现丢失EpCAM表面抗原的现象，而该方法只能检测到带EpCAM表面抗原的CTC（J Transl Med 2012;10:138）。研究显示患者在使用了贝伐单抗治疗后，用该类方法无法检测到存在的CTC，可能是由于该类药物促进了EMT的发生或者EMT的肿瘤细胞被药物选择存活下来（Ann Oncol 2011; 22:1929）。

2）不同癌症种类携带EpCAM抗原的CTC比例不同，基于EpCAM捕获的技术应用于肺癌时受到的限制最大（Brit J Cancer 2011; 105:847）。如ALK基因融合阳性的肺癌CTC，有超过一半该类方法无法检测到（J Clin Oncol 2013; 31:2273）。部分癌症亚型的CTC细胞表面甚至不表达EpCAM抗原，如normal-like乳腺癌的CTC，该类方法就无法检测到（J Natl Cancer Inst 2009; 101:61）。

3）该类方法对CTM漏检率较高，可能由于CTM多为间质细胞表型、CTM体积较大磁珠捕获效率低、操作步骤多易使CTM人为分散或者CTM中的CTC被血细胞包裹（Theranostics 2013;3:377）。

依据细胞大小、通过滤膜直接富集CTC的方法，亦称为ISET法（Isolation by Size ofEpithelial Tumor cells）。ISET法操作步骤一般较少，因此处理时间较短；由于不需依靠抗体分离，所以不存在上述免疫捕获法丢失CTC的因素。无论从原理上或是研究实践均证明，ISET法对CTM的富集效果比免疫捕获法好。

ISET法亦会丢失CTC，主要是直径小于滤膜孔径的CTC，和存活状态不好甚或因凋亡而萎缩的CTC（Theranostics 2013; 3:377），因此其丢失的大部分CTC是侵袭性较弱的。有研究将ISET法与免疫捕获法进行直接比较，发现在肺癌和前列腺癌中ISET法富集的CTC阳性率、CTC个数和CTM阳性率均高于免疫捕获法；在乳腺癌中ISET法富集的CTC阳性率高于但CTC个数低于免疫捕获法（Brit J Cancer 2011; 105:847；J Thorac Oncol 2012;7:306）。

ISET法的另一个不足是获得的CTC纯度较低，但结合第二种富集参数可显著提高纯度。

推动CTC检测在肿瘤研究和临床上的运用，需要新的思路，也需要更全面更可靠的新一代CTC富集技术的出现。CTC检测需要抓住关键，研究最具转移潜能的CTC，才能将CTC的潜在价值转化为临床应用。

近年有研究报道，采用免疫磁珠负向富集法可去除高达99.9%的白细胞，并且对CTC的回收率是免疫捕获法的两倍以上（66% vs. 26%）（J Transl Med 2011; 9:70）。而将免疫磁珠负向去除白细胞与ISET法相结合，既能保证CTC回收率又可提高纯度，又能克服现有富集方法的缺陷（可以捕获CTM和EMT的CTC，下游技术怎么检测，大家可以在公众号回复“CTC”进行查看）。ISET法富集获得的CTCs结合在滤膜上，便于保存，亦可灵活的进行免疫荧光、FISH、分子检测等分析，还可以通过显微切割对单个CTC进行全基因组分析。

三种CTC富集技术的对比